Alternatywy dla testów na zwierzętach

AlternatywyOMÓWIENIE NAJWAŻNIEJSZYCH BADAŃ Z PERSPEKTYWY ROZPORZĄDZENIA Z 2013 ROKU.

Wszyscy zdajemy sobie sprawę z tego, że każdy kosmetyk zanim pojawi się na linii produkcyjnej i trafi na sklepowe półki, musi zostać wcześniej poddany rygorystycznym testom. Po pierwsze – firmom testowanie kosmetyków i ich składowych narzucone jest odgórnie, po drugie – żadna szanująca się firma nie może pozwolić sobie na to, by wyprodukowany przez nią produkt w jakikolwiek sposób mógł zaszkodzić człowiekowi. Mówimy tutaj o wielkiej odpowiedzialności w kwestii naszego zdrowia i równie dużych karach nałożonych na firmę, w razie niespełnienia wszystkich wymogów bezpieczeństwa konsumentów.

W czasie trwania batalii o wprowadzenie ustawy z 2013 roku w sprawie zakazu testowania produktów kosmetycznych i ich składowych na zwierzętach, największym problemem okazało się zastąpienie alternatywnymi badań (tzw. „endpoints”), w stosunku do których środowisko naukowe i medyczne było nastawione najbardziej konserwatywnie. Gdyby nie działania organizacji pro-zwierzęcych czynnie działających na polu zwalczania wiwisekcji, niewiele brakowało do odroczenia rozporządzenia na kolejne lata.

Oto najważniejsze badania:

1. Uczulenia skóry

Wyjaśnienie: Uczulenie jest reakcją alergiczną na konkretną substancję, czego efektem jest zapalenie skóry i swędzenie. Z każdą ekspozycją na substancję skóra staje się na nią coraz bardziej wrażliwa. Testy wykorzystujące myszy i świnki morskie są w stanie przewidzieć reakcję uczuleniową u ludzi jedynie w 72% przypadków.

Alternatywy: Mechanizm tego, jak skóra reaguje na substancję uczulającą jest bardzo dobrze poznany. Kluczowym elementem jest „haptenacja” – czyli reakcja białek skóry na substancję. Możliwe jest zatem określenie stopnia „uczuleniowości” w zależności od tego, w jaki sposób wiąże się z białkami in vitro (np. w probówce). Jednym z takich testów, stosowanym od początku XXI wieku jest test reaktywności białek (Bezpośrednie Badanie Reaktywności Peptydów – DPRA), niemal całkowicie prewalidowany przez ECVAM. Udowodniono już jego skuteczność w przypadku 89% substancji. Podobny stopień prawdopodobieństwa możemy zaobserwować przy użyciu komputerowych modeli QSARów, lub przynajmniej dwóch metod in vitro (MUSST i hCLAT) wykorzystujących komórki skóry.

„Czy substancja może uczulać czy też nie, a jeśli może, to w jakim stopniu, zależy od niczego innego jak tylko jej właściwości chemicznych”

Dr Dave Roberts, specjalista uczuleń skóry, Uniwesytet Johna Morre’a, Liverpool.

2. Rakotwórczość

Wyjaśnienie: Karcerogenem nazywamy substancję, która powoduje powstanie nowotworu lub zwiększa prawdopodobieństwo jego rozwoju. Testy przeprowadzane na zwierzętach trwają długo (dwa lata), są mało wiarygodne, drogie, a ich przewidywalność określa się na jedyne 42%. Z tego względu, jak przyznają eksperci, przeprowadzane są niezmiernie rzadko.

Alternatywa: Nowotwór często powstaje na skutek uszkodzenia genów w komórkach ciała (tzw. karcerogen genotoksyczny). Tego typu substacje rozpoznaje się poprzez szereg długotrwałych badań opartych na komórkowych testach in vitro. Uznaje się je, co prawda, za zbyt wrażliwe, ale w ostatnim czasie wykazano ich dużą przewidywalność. Bardziej udoskonaloną metodą są Testy Transformacji Komórkowych (CTA) wykorzystujące komórki gryzoni (Embrion Chomika Syryjskiego [SHE], komórki Balb/c3T3 orazz Bhas42) stosowane już od ponad 40 lat, potrafią wykryć wszystkie znane karcerogeny mając jednocześnie nawet 95% przewidywalność.

Należy podkreślić, że badania nad karcerogennością nie były ujęte w Dyrektywie Kosmetycznej a SCCP oczekiwało ich jedynie sporadycznie. Dobrą, nie-zwierzęcą alternatywą jest w tym wypadku połączenie badań metodą (in vitro) nad genotoksycznością z badaniami CTA oraz podejściu TTC opartego na ekspozycji danej substancji.

Powyższe fakty dobrze obrazuje przykładowa tabela z raportu BUAV

Alternatywa

Potwierdzenie wiarygodności

Status

karcerogeny neurotoksyczne

Test odwróconej mutacji bakterii (test Amesa)

Przeprowadzane w późnych latach 50’. Badania dobrze przygotowane i zaakceptowane przez środowisko naukowe. Wykryto 90%  karcerogenów u gryzoni kiedy połączono testy MTA oraz MNT. 77% skuteczności w przypadku  368 substancji chemicznych. Uznany dla powodów regulacyjnych (OECD TG 471, 1997r.)
Test mutacji genu in vitro w komórkach ssaków (MLA) 90% z 553 karcerogenów występujących u gryzoni zlokalizowano łącząc badania MNT z testem Amesa. Uznany dla powodówregulacyjnych(OECD TG 471, 1997r.)
Test abberacji chhromosomów in vitro w komórkach ssaków (CA) 85% z 553 karcerogenów występujących u gryzoni zlokalizowano łącząc badania MNT z testem Amesa. Uznany dla powodówregulacyjnych(OECD TG 471, 1997r.)
Mikrojądrowebadaniein vitro w komórkach ssaków (MNT) 90% z 553 karcerogenów występujących u gryzoni zlokalizowano łącząc badania MNT z testem Amesa. Uznano 83% w 113 substancjach chemicznych w walidacyjnych badaniach ECVAM Zatwierdzone przez ECVAM w 2006 r. Uznany dla powodówregulacyjnych(OECD TG 471, 1997r.)

genotoksyczne i niegenotoksyczne karcerogeny

 

 

Badanie transformacji komórkowej (CTA oraz komórki SHE, Balb/3T3 i Bhas42) Badaniazatwierdzonew latach60’. Inspekcja OECD w 2007 r. uznała, że 90%-95% karcerogenów może być wykryta. Laboratorium ECVAM dowiodło istnienia 80-83% karcegorenów spotykanych u gryzoni w 213 substancjach. Badania P&G wykazały 85% zgodność z danymi dot. karcerogenów u gryzoni w 56% substancji chemicznych. Badania Pfizera wykazały 89% zgodność w przypadku 19%substancji. Przeprowadzone w testach wytycznych rekomendowanych przez OECD w 2006 r. Prewalidację ECVAM ukończono w 2009 dla SHE oraz Balb/3T3, nadal trwających dla Bhas42 (oświadczenia spodziewano się w 2010 r.)

 

 

“Dwuletnie biotesty przeprowadzane są rzadko ze względu na ich wysokie koszty i niewielką wiarygodność gdy mowa o składnikach kosmetycznych, nie wspominając o kwestii dobrostanu zwierząt. Lepsze rezultaty można otrzymać poprzez kombinację róznych badań, wliczając testy transformacji komórkowych oraz, wreszcie, stosując podejście toksykogenomiczne.”

Dr Annamaria Colacci,  Centrum Karcynogenezy Środowiskowej i Oceny Ryzyka, Agencja Ochrony Środowiska i Profilaktyki Zdrowotnej, Emilia Romania, Włochy.

3. Toksykokinetyka

Wyjaśnienie: Badania toksykokinetyczne prowadzone są w celu uzyskania informacji nt. tego w jaki sposób substancja jest pochłaniana, rozprowadzana, trawiona i wydalana z ciała (tzw. badania ADME – absorb, distribute, metabolise, excrete). Tego typu informacje są istotne, ponieważ pomagają w rozpoznaniu prawdopodobieństwa wystąpienia niekorzystnych efektów oraz jak substancja może wpłynąć na ludzki organizm. Absorpcja polega na pokonaniu przez substancję naturalnych barier ochronnych ciała, dzięki czemu może wniknąć do jego wnętrza (np. przez krew lub tkanki); metabolizm to praca wątroby, której zadaniem jest rozbicie substancji na mniejsze części; i wydalanie, czyli to w jaki sposób substancja zostaje wyeliminowana przez organizm – głownie za sprawą nerek i moczu. Zwierzęcy metabolizm i fizjologia znacznie różnią się od ludzkich. W rezultacie, zanim dla przemysłu farmaceutycznego standardem stały się badania ADME in vitro na ludzkich komórkach, wskaźnik nieskuteczności leków w badaniach klinicznych przy słabej przewidywalności ADME wynosił 40% – teraz to jedynie 10%.

Alternatywy: Istotne etapy toksykokinetyczne można modelować za pomocą matematycznych modeli opartych na toksykokinetyce (PBTK). Modele te składają się z zestawu fizjologicznych i chemicznych parametrów, które są w stanie przewidzieć dystrybucję i wydalanie substancji przez ludzkie ciało po uprzedniej początkowej informacji dot. jej wchłaniania i metabolizmu. Przemysł farmaceutyczny posiada coraz większą wiedzę nt. takich modeli, stosuje je już od lat ’70.  Skóra jest główną drogą przez którą wchłaniany jest kosmetyk i jesteśmy już wstanie ją odtworzyć za pomocą prawnie uregulowanych metod in vitro. Metabolizm można przewidzieć stosując badania o dużej przepustowości, wykorzystujące hodowlane komórki ludzkich hepatocytów (komórek wątroby). Z tego typu badań korzysta większość firm farmaceutycznych.

4. Toksyczność po podaniu wielokrotnym

Wyjaśnienie: Testy wielokrotnie powtarzanej dawki są testami, podczas których dochodzi do długotwałej i postępującej dysfuncji komórek, narządów lub całych układów na skutek ich ekspozycji na daną substancję. Głównym miejscem potencjalnego zakażenia jest wątroba (hepatotoksyczność), a praca wątroby, inna od ludzkiej, jest kluczowym elementem podczas obserwacji różnic międzygatunkowych w kwestii toksyczności leków i związków chemicznych. Część dokumentacji recenzujących przewidywalność testów przeprowadzanych na zwierzętach w zakresie toksyczności dla ludzi, głównie w obszarze produktów farmaceutycznych,  dowodzi ich niewielkiej przewidywalności wahającej się w granicach 40-60%.

Alternatywy: Niektóre z modeli in vitro, powstałych jako metody samodzielne, są obecnie na różnych etapach rozwoju/walidacji w kwestii najpowszechniejszych celów badań nad toksycznością. Mimo istniejących dowodów świadczących o tym, że ww. modele są w stanie przewidzieć efekty (powtarzanej dawki) mające miejsce w ludzkim organizmie, to z praktycznego punktu widzenia najistotniejsza kwestią jest połączenie wyników różnych badań w pojedynczy „współczynnik bezpieczeństwa” w celu oceny potencjalnego ryzyka wielokrotnej ekspozycji na daną substancję.

Informacje na temat wielokrotnie powtarzanej dawki (“NOAEL”) stanowią wymóg dla nowych składników kosmetycznych, ale w wielu przypadkach możliwe jest ich zastąpienie poprzez zastosowanie koncepcji TTC, ponieważ dawki te są tak małe, że nie mogą powodować żadnych efektów ubocznych. W sytuacjach, kiedy taka metoda okazałaby się niemożliwa do zastosowania, należałoby przeprowadzić szereg testów in vitro skupiających się na pracy wątroby, stanowiącej główny cel badań nad toksycznością dawki wielokrotnie powtarzanej. Następnie badania powinny skupić się na nerkach, sercu, płucach oraz układzie nerwowym i odpornościowym – najwrażliwszych na powtarzane dawki. Możliwe jest również wykorzystanie w tej sytuacji komputerowych modeli QSARów.

“To jasne, że testy przeprowadzane na zwierzętach mają swoje granice; nie jesteśmy 70-kilogramowymi szczurami.”

Dr Thomas Hartung, Prezes Europejskiego Centrum Walidacji Metod Alternatywnych, Włochy.

5. Toksyczny wpływ na reprodukcję

Wyjaśnienie: Toksyczny wpływ na reprodukcję jest terminem odwołującym się do szeroko rozumianych skutków ubocznych, mających miejsce w czasie którejkolwiek fazy cyklu reprodukcyjnego, wliczając również te mające wpływ na płodność kobiet i mężczyzn, zachowania seksualne, proces zapłodnienia, rozwój zarodka, narodziny i dojrzewanie dziecka. Testy przeprowadzane na zwierzętach mające wykazać toksyczny wpływ na reprodukcję, trwają niezmiernie długo i pochłaniają życie tysięcy zwierząt. Co więcej, szereg badań w tym temacie wykazało, że są w stanie wykryć jedynie 60% z dotychczas poznanych substancji, o których z reprodukcyjnej toksyczności już wiemy.

Alternatywy:  Istnieje wiele metod, m.in wykorzystujących ludzkie zarodki, komórki macierzyste oraz wiązania receptorów, które zostały już rozwinięte lub zatwierdzone zgodnie z zasadami przyjętymi przez ECVAM oraz/albo stanowią wytyczne OECD (Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju).  W przypadku niektórych z ww. metod zdołano już wykazać, w celach określonych przez regulacje prawne, ich dużą przewidywalność w zakresie potencjalnej toksyczności. Prawdopodobnie nie istnieje konieczność testowania substancji w zakresie ich toksyczności dla wszystkich faz cyklu reprodukcyjnego, ponieważ każda z nich wykazuje inną wrażliwość na takie substancje. Dla przykładu – EST (badanie komórek macierzystych zarodków) obejmuje rozwój zarodka, czyli jedną z najbardziej wrażliwych faz.

Połączenie powyższych metod, obejmujących najbardziej wrażliwe fazy cyklu reprodukcyjnego, jest w stanie przewidzieć czy pewność co do reprodukcyjnej toksyczności danej substancji mieści się jeszcze w akceptowalnych granicach. Unijny projekt ReProTect wykazał ostatnimi czasy, że szereg testów przeprowadzanych na komórkach „jest w stanie skutecznie przewidzieć wszelkie skutki uboczne substancji, mających wpływ na płodność oraz rozwój zarodka”, z łączną dokładnością od 70 do 100%  dla 10 testów przeprowadzanych na różnych substancjach.

W tym momencie należałoby spojrzeć na wyżej przytoczone metody z perspektywy niskiej przewidywalności badań przeprowadzanych na zwierzętach, oraz wziąć pod uwagę fakt – w związku z niską ekspozycją konkretnych składników kosmetycznych na ludzki organizm – że testy reprodukcyjnej toksyczności nie były ujęte w Dyrektywie Kosmetycznej. Firmy kosmetyczne wyłącznie z własnej woli podejmowały się przeprowadzenia takich badań, zazwyczaj jedynie w celu ich udoskonalenia,  kiedy podobne efekty przyniosłyby testy EST lub te oparte na podejście TTC.

„Dyrekcja Generalna ds. Zdrowia i Bezpieczeństwa Konsumentów nie może zaakceptować faktu, że obiecujące rezultaty studium wykonalności ReProTect, sponsorowane przez Komisje Badań DG, nigdy nie zostały przedstawione [w raporcie ekspertów].”

Prof.Horst Spelmann, Profesor Regulacji Toksykologii na Berlińskim Uniwersytecie Freie; doradca prezesa BfR (Federalny Instutu Oceny Ryzyka), Niemcy.

 

Ozi